真田幸隆之三子。青年时仕于武田家,才华出众,担任武田信玄的近习。父亲幸隆死后,在长筱合战中,兄长信纲与昌辉战死,因此昌幸得以继承真田家。
天正十年(1582年),由于织田德川联合军的攻击,武田家灭亡,真田家成为甲信地方的一个小大名。后来,真田家臣从于丰臣家,昌幸仕于丰臣秀吉,很受秀吉器重,秀吉曾评价昌幸为“表里如一之人”。秀吉死后,庆长五年(1600年)关原之战爆发。由于昌幸长子真田信幸娶了本多忠胜之女本多小松为妻,因此在关原会战中昌幸跟次子真田幸村属于西军,而信幸属于东军。会战中昌幸以数千之兵对付奔向关原的德川秀忠三万八千大军,一度将秀忠军钉死在信浓。关原会战以东军取胜告终,昌幸跟幸村由于信幸的关系得以保全性命,到高野山隐居。庆长十六年(1611年)昌幸在高野山去世,据说去世前每日朝晨必朝拜秀吉像,以感激秀吉知遇之恩。
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